盡管科學家們?nèi)圆煌耆私釸NA分子的多樣性，但據(jù)信與它們結(jié)合的蛋白稱為RNA結(jié)合蛋白，與多種疾病形成有關(guān)。香港城市大學(CityU)生物醫(yī)學科學家領(lǐng)導的研究導致了一種名為CARPID的新型檢測方法，該方法可鑒定活細胞中特定RNA的結(jié)合蛋白。有望將該創(chuàng)新技術(shù)應(yīng)用于各種類型的細胞研究，從鑒定癌癥診斷的生物標志物到檢測治療病毒性疾病的潛在藥物靶標。

這項研究由城大生物醫(yī)學系(BMS)的嚴堅博士，張亮博士和陳奎明博士與西安西北大學的科學家共同領(lǐng)導。一個。他們的發(fā)現(xiàn)發(fā)表在科學雜志《自然方法》上，標題為“ CRISPR輔助檢測活細胞中RNA-蛋白質(zhì)相互作用”。

結(jié)合蛋白決定RNA功能

分子生物學的中心教條表明，DNA被轉(zhuǎn)錄為RNA，RNA被翻譯為蛋白質(zhì)。但實際上，只有大約2%的RNA編碼蛋白質(zhì)。其余98%的非編碼RNA(ncRNA)因其神秘的功能而被視為“暗物質(zhì)”。

近年來，科學家付出了很多努力來揭示RNA的實際功能，尤其是長的非編碼RNA(lncRNA，即長度超過200個核苷酸的ncRNA)。LncRNA已被廣泛接受為參與基因表達調(diào)控的重要細胞成分。嚴博士說：“ LncRNA是最有趣的RNA種類。”這也是該團隊選擇lncRNA作為研究對象的原因。

盡管lncRNA不產(chǎn)生蛋白質(zhì)，但它們將與蛋白質(zhì)反應(yīng)，相互作用將決定其功能。因此，結(jié)合蛋白的鑒定對于理解lncRNA功能至關(guān)重要。然而，當前的方法表現(xiàn)出許多局限性，例如產(chǎn)生假陽性信號，并且不能在活細胞中完成。

CARPID的兩個步驟：導航和生物素標記

為了克服現(xiàn)有方法的局限性，研究團隊提出了一種新穎的方法，該方法可以聯(lián)合利用現(xiàn)有的最新基因編輯技術(shù)CRISPR / dCasRx系統(tǒng)進行RNA靶向，并采用鄰近生物素標記技術(shù)進行鑒定活細胞中蛋白質(zhì)之間的相互作用。

該團隊將新方法命名為CARPID，它是CRISPR輔助RNA-蛋白質(zhì)相互作用檢測的縮寫。嚴博士說：“ CARPID可以靈敏地檢測任何長度或濃度的RNA結(jié)合蛋白，而大多數(shù)其他方法只能應(yīng)用于很長的非編碼RNA。”

該方法由兩部分組成：導航和鄰近生物素標記。首先，該團隊采用CRISPR / CasRx系統(tǒng)進行導航，以便CARPID組件(包括稱為BASU的“標記工具”)可以接近目標RNA。BASU是一種工程化的生物素連接酶，是一種將生物素(一種具有強結(jié)合力的維生素)添加到與目標RNA結(jié)合的蛋白質(zhì)上的酶。以此方式，將標記接近靶RNA的那些蛋白質(zhì)。

標記后，研究小組隨后使用一種稱為鏈霉親和素的生物素結(jié)合蛋白來鑒定那些被BASU標記的蛋白。這樣，結(jié)合蛋白容易被揭示。

對不同長度的lncRNA具有高度的特異性和適用性

為了測試CARPID的特異性，研究小組將其應(yīng)用于三種不同的lncRNA，即DANCR，XIST和MALAT1。實驗結(jié)果表明結(jié)合蛋白沒有太多的重疊。這證明了CARPID方法對不同長度和表達水平的lncRNA的高度特異性和適用性。

嚴博士解釋說：“之所以能達到如此高的特異性，是因為CRISPR的導航非常精確。我們甚至可以準確地獲得蛋白質(zhì)結(jié)合發(fā)生在RNA哪一部分的信息。”

同樣，CARPID不會影響目標細胞的生理狀況，并且在整個過程之后，該細胞仍然活著并具有正常的基因表達格局。張博士補充說：“通過這種新方法，如果我們在不同時間檢查相同的RNA靶標，我們可以獲得動態(tài)結(jié)果。”

在張博士開發(fā)的蛋白質(zhì)組學(蛋白質(zhì)分析)技術(shù)的支持下，該團隊能夠發(fā)現(xiàn)和驗證哺乳動物細胞中l(wèi)ncRNA的兩個先前未表征的結(jié)合蛋白。

病毒RNA結(jié)合蛋白的檢測

該團隊認為CARPID具有廣泛的應(yīng)用，包括檢測病毒RNA的結(jié)合蛋白。“例如，SARS-CoV-2是一種引起COVID-19的RNA病毒。一旦病毒感染細胞，我們就可以應(yīng)用CARPID來檢測該病毒在病毒生命周期中募集的細胞蛋白。如果我們消除了這種結(jié)合，蛋白質(zhì)，我們很可能會抑制病毒的復制。這些信息可能有助于我們確定潛在的抗病毒藥物靶標。”

此外，許多l(xiāng)ncRNA被用作癌癥的診斷生物標志物，因為它們在癌細胞中比正常細胞變得更加豐富。CARPID可用于檢測癌細胞中這些lncRNA 的結(jié)合蛋白，這可能有助于尋找致癌機制和潛在的蛋白靶標，用于癌癥的診斷或治療。

團隊花了大約一年的時間開發(fā)CARPID，并且大部分實驗都是在CityU進行的。他們的下一步將嘗試將其應(yīng)用于干細胞和DANCR(一種通常用作腫瘤啟動子的lncRNA)的研究。